质粒提取步骤

一、实验原理:
        碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0 ~12.5 这个狭窄的范围内,线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH 4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时,共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA ,蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
 
二、操作步骤:
        1. 准备20ml灭菌过的培养管,编号,分别加入8ml LB培养基,再加入8µl 相应抗生素,可适量多加;

        2. 用10µl 白色枪头挑取挑取单个菌落至培养管中,37℃震荡过夜(274rpm);
        3. 取2ml过夜培养的菌液加入离心管中,室温10000rpm离心2min,去上清;(可重复步骤2,直至菌液离心完)(去上清时用纸吸一下)
        4. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl Buffer P1(含RNase A),使用移液枪充分混匀,悬浮菌体菌体;
        5. 向离心管中加入250µl Buffer P2,温和地上下颠倒混匀4~6次,获得澄清的裂解液;(剧烈混合会使剪切染色体DNA,降低质粒纯度)
        6. 向离心管中加入350µl Buffer N3, 立即温和地上下颠倒混匀4~6次,此时出现白色絮状沉淀。室温10000rpm离心15min;
        7. 小心将步骤6中所得的上清液转移至洁净的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000rpm离心1min,至裂解物完全通过吸收柱,倒掉收集管中的废液;
        8. 向吸附柱中加150µl Buffer PB,10000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液;
        9. 向吸附柱中加400µl  Buffer PW(检查是否加入无水乙醇),10000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液。再空离一次,2min(此时可以加热 Buffer EB,65~70℃);
        10. 将吸附柱置于一个新的离心管中,打开盖子,吹风4min左右(确保乙醇被去除,乙醇会影响下面的步骤);
        11. 向吸附柱的吸附膜中间部位加90µl Buffer EB(pET系列拷贝数低,加EB 70μl即可),室温静置2min。10000rpm离心1min;
        12. 把液体倒回吸附柱,在10000rpm离心1min;
        13. 混合质粒至一个离心管中,做好标记,开盖室温放置两小时左右。-40℃保存质粒。
 
三、注意事项:

        1.使用之前,把试剂盒中的一小管RNA酶加入Buffer P1, 4℃保存。
        2.Buffer EB在65~70℃水浴预热,可以增加提取效率。