质粒图谱的主要构成元件

1.复制起始位点（Ori）

定义：控制质粒复制的起始点。

特点：原核生物DNA分子中通常只有一个复制起始点，而真核生物DNA分子则可能有多个。

作用：决定了质粒的宿主和拷贝数。

识别方法：图谱上Ori的箭头指复制方向，一般在大肠杆菌中是pUC类的，还有一种F1启动子代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA，可以用来测序。

类型判断：图谱上只有一个Ori的质粒可能是原核克隆及表达质粒；有两个Ori的质粒可能是穿梭质粒，既可以在原核也可以在真核中复制。

 

2.筛选标记

定义：多为抗生素抗性基因，用于检测盒筛选含有质粒的细胞。

常见类型：AmpR（氨苄青霉素抗性）、Tetr（四环素抗性）、Camr（氯霉素抗性）、Kanr（卡那霉素抗性）、Hygr（潮霉素抗性）等。

作用：方便后续通过抗生素筛选阳性克隆。只在一种宿主中复制的质粒仅具有一种抗性筛选标记，如原核克隆载体和原核表达载体；能够在两种类型宿主中复制和表达的载体会具有两种筛选标记，如穿梭质粒。

 

3.多克隆位点（MCS）

定义：外源基因的插入位点，为一系列限制性内切酶酶切位点。

特点：每个限制性内切酶位点在整个载体质粒中是唯一的，一般可通过酶切后连接的方式将外源DNA插入质粒。

位置：多克隆位点一般位于转录启动和转录终止信号之间。

注意事项：在构建质粒时，需要仔细检查MCS上的酶切位点，了解哪些酶可以用于切割质粒以插入外源基因。同时，注意酶切位点的排列和位置，以便选择合适的酶进行切割。

 

4.其他元件

转录调控元件：如启动子（P）、增强子/沉默子等。启动子是促进DNA转录的DNA顺序，常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNA聚合酶（RNApol）特异性结合并使之开始转录的部位。增强子为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序，其作用与增强子所在的位置或方向无关，在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子为负增强子，负调控序列。

翻译调控元件：如核糖体结合位点（Rbs）、起始密码（AUG）、SD序列（Shine-Dalgarno sequence）等。这些元件对于质粒的表达和调控至关重要。

终止信号：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点下游有一段GT或T富丰区，这两部分共同构成poly（A）加尾信号，可以起到稳定mRNA的作用。

蛋白标签：通常为较短的短肽，一般通过融合表达的方式连接在目的基因的3’或5’端，常见的标签包括Flag、Myc、GST、HA和His等。

 

如何看懂质粒图谱

1.看Ori的位置：了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）。

2.看筛选标记：决定使用什么筛选标记，如抗性。

3.看MCS：决定能不能放目的基因以及如何防止目的基因。

4.看外源DNA插入片段大小：质粒一般只能容纳小于1Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。

5.看表达系统元件：即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号，这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。

6.看质粒图谱上的箭头：有的箭头顺时针，有的逆时针，代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA。它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上。

 

用大家常用的pcDNA3.1(+)表达载体作为案例:

第一步：了解质粒图谱中的复制起点

如图谱中(图一)的ori表示质粒的复制起点。质粒的复制起点决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数相关。若图谱上只有一个ori，表示质粒是原核克隆及表达质粒。而图谱上有两个ori，则表示该质粒是穿梭质粒，既可以在原核也可以在真核中复制。

图一

 

第二步：了解质粒图谱中的筛选标记

图谱中(图二)的AmpR、KanR等表示质粒载体中的筛选标签，多为抗生素抗性基因，方便后续通过抗生素筛选阳性克隆。只存在单抗性的质粒多为原核克隆载体和原核表达载体。而存在两种或以上的抗性的多为穿梭质粒。

如何确定质粒的抗性：首先根据质粒的图谱和序列确定质粒的抗性基因，再确定抗性基因前面是否有启动子，并且分析该启动子的适用范围。

常用真核启动子有CMV、SV40、EF1a、U6等，原核启动子有T7、sp6、lac、Amp等。

图二

第三步：了解质粒图谱中的多克隆位点

图谱中的MCS区或者许多内切酶集中的部分，就是质粒的多克隆位点。多克隆位点为一系列限制性内切酶酶切位点，是外源DNA的插入位点，一般可通过酶切后连接的方式将外源DNA插入质粒。多克隆位点一般位于转录启动和转录终止信号之间。

      

第四步：了解质粒图谱中其它元件

质粒载体中除复制起始位点、筛选标记、多克隆位点外，还具有其他一些表达或调控元件，如转录调控元件、翻译调控元件和融合表达标签蛋白等。

比如：

蛋白纯化标签蛋白：His-Tag，GST-tag等

蛋白检测标签蛋白：Myc-Tag，Flag-Tag，HA-Taq等

荧光蛋白表达标签：GFP，mCherry等