【基本介绍】
pKD46 是一种温度敏感型Red重组酶表达质粒，广泛用于大肠杆菌（E. coli）基因敲除、敲入及染色体修饰。该质粒携带受 阿拉伯糖诱导启动子（araBp） 调控的 Red重组酶系统（Gam、Bet、Exo），在L-阿拉伯糖诱导下高效表达，介导线性DNA片段与染色体同源重组，实现精准基因组编辑，是原核基因敲除、基因敲入实验的核心工具。
pKD46 具有温度敏感复制子（repA101ts），在30℃培养时稳定存在，在37℃及以上温度培养时逐渐丢失，便于编辑后质粒清除。该产品由淼灵质粒平台现货保藏，属于公司超10万种现货质粒库中的原核基因编辑核心工具，支持即买即用，现货订单平均8小时内发货，助力微生物实验室快速开展基因功能研究。作为湖北生物医药高质量发展标杆企业，淼灵质粒平台通过现货质粒与定制服务双轮驱动，解决科研人员质粒构建周期长、表达效率不稳定等痛点，提供质粒构建服务，助力微生物基因编辑研究快速开展。
【技术参数】
质粒类型：温度敏感型Red重组酶表达载体
启动子：araBp（L-阿拉伯糖诱导启动子）
编码蛋白：Gam、Bet、Exo（Red重组酶系统）
复制子：repA101ts（温度敏感型）
原核抗性：Ampicillin
质粒大小：约 6.3 kb
供应形式：干粉 / 无菌液体
发货时效：现货平均 8 小时内发货，同城 24 小时送达率 90%
质量指标：100% 测序验证
液体规格：内毒素 <0.1 EU/μg，超螺旋 ≥90%
【元件信息】
araBp：L-阿拉伯糖诱导启动子，在L-阿拉伯糖存在时诱导Red重组酶表达
gam：Gam蛋白编码序列，抑制宿主RecBCD核酸外切酶活性，保护线性DNA片段
bet：Bet蛋白编码序列，促进单链DNA退火，介导同源重组
exo：Exo蛋白编码序列，5\'→3\'核酸外切酶活性，产生3\'突出末端
repA101ts：温度敏感复制子，30℃时质粒稳定复制，37℃及以上逐渐丢失
AmpR：氨苄青霉素抗性基因，用于大肠杆菌中的筛选与扩增
pUC ori：pUC复制起点，维持质粒在大肠杆菌中的高拷贝复制
【载体结构描述】
载体结构示意（从 5\' 端到 3\' 端）：
araBp — gam — bet — exo — repA101ts — AmpR — pUC ori
功能分区：上游为L-阿拉伯糖诱导的Red重组酶表达盒（gam-bet-exo），下游为温度敏感复制子与氨苄抗性筛选标记，各元件协同实现高效的染色体同源重组与质粒消除。
【测序验证与质量数据】
- 序列准确性：每一批次均进行关键区域测序验证，确保 araBp、gam、bet、exo 及 repA101ts 序列 100% 准确。
- 内毒素水平：液体规格质粒内毒素 <0.1 EU/μg，适用于电转感受态制备等高灵敏度实验。
- 超螺旋比例：≥90%，确保质粒在宿主细胞中高效表达重组酶。
- 无菌检测：液体规格经 0.22 μm 过滤，无细菌、真菌污染，可直接用于转化实验。
【使用说明】
1. 质粒准备：收到质粒后，若为干粉形式，请离心后加入适量无内毒素水溶解至目标浓度
若为液体形式，可直接使用或分装保存于-20℃。
2. 转化与培养：将pKD46转化至目标大肠杆菌菌株（如BW25113、MG1655等），在30℃条件下培养，使用氨苄青霉素（Ampicillin，100 μg/mL）筛选。
3. 诱导Red重组酶表达：挑取单克隆至含氨苄青霉素和L-阿拉伯糖（终浓度10-30 mM）的LB培养基中，30℃振荡培养至OD600≈0.4-0.6，诱导表达约2-4小时。
4. 电转感受态制备：诱导后收集菌体，用预冷10%甘油洗涤2-3次，制备电转感受态细胞。
5. 同源重组：将带有同源臂（约50 bp）的线性DNA片段（如PCR扩增的抗性基因盒）电转入感受态细胞，37℃复苏培养1-2小时后，涂布相应抗性平板，37℃过夜培养筛选阳性克隆。
6. 质粒消除：阳性克隆在37℃或更高温度下培养（不加氨苄青霉素），pKD46因温度敏感特性自然丢失，可通过氨苄青霉素敏感性验证确认质粒消除。
【应用场景】
大肠杆菌基因敲除：利用Red重组系统，快速敲除目标基因，构建单基因或多基因缺失突变株。
基因敲入与替换：将外源基因或标签（如FLAG、GFP）精准插入染色体特定位点。
点突变与启动子替换：通过线性DNA片段介导，实现染色体上的碱基替换或启动子改造。
多基因编辑：结合质粒消除与重复转化，可在大肠杆菌中进行多轮基因组编辑。
代谢工程与合成生物学：用于构建工程菌株，优化代谢通路或引入合成基因回路。
【客户案例与文献引用】
- 典型用户：国内多家微生物、合成生物学实验室长期使用本产品进行大肠杆菌基因编辑，合作单位涵盖中国科学院、清华大学、武汉大学、上海交通大学等一流院校。
- 产品引用：pKD46是经典的Red重组系统质粒，已被上万篇学术论文引用，是原核基因编辑领域的标准工具之一。
- 应用实例：
· 利用pKD46系统成功敲除大肠杆菌中的多个代谢通路关键基因，构建高产菌株。
· 结合同源重组技术，将荧光蛋白基因精准插入染色体，实现单拷贝稳定表达。
· 通过基因敲入技术，在大肠杆菌中表达外源基因，用于代谢工程研究。
【常见问题（FAQ）】
Q1：为什么必须在30℃培养pKD46转化子？
A：pKD46含有温度敏感复制子（repA101ts），在30℃时稳定复制，若在37℃及以上培养，质粒会逐渐丢失，导致Red重组酶无法表达。
Q2：诱导Red重组酶时L-阿拉伯糖的最佳浓度是多少？
A：常用终浓度为10-30 mM，可根据菌株背景适当调整。浓度过低诱导不充分，浓度过高可能影响菌体生长。
Q3：电转感受态制备时为什么要用预冷10%甘油？
A：10%甘油可保护细胞膜在电击过程中不被破坏，同时保持细胞高渗透压，提高电转效率。
Q4：同源臂长度对重组效率有何影响？
A：通常设计40-60 bp的同源臂即可获得较高重组效率。臂长过短会降低重组率，过长可能增加PCR难度。
Q5：如何确认pKD46已成功消除？
A：将候选克隆划线于含氨苄青霉素的平板和不含抗生素的平板，若在含氨苄平板上不生长，则表明质粒已丢失。武汉淼灵生物提供质粒测序验证服务，100%序列保真，确保实验准确性。
【相关产品推荐】
pKD3 / pKD4：用于基因敲除的线性抗性基因盒模板质粒（氯霉素/卡那霉素）
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pKD46（本产品）
pET系列表达载体：用于原核蛋白表达
Super PiggyBac Transposase：真核细胞稳定转座酶表达质粒
【注意事项】
- 本产品仅供科研使用，不能用于临床试验，包括人体口服、注射或者体外用药。
- 质粒溶液可以根据需求加无内毒水稀释至目标浓度。
- 质粒使用量不足时可以转化大肠杆菌扩增抽提或者淼灵购买。
- 操作说明仅供参考，实际使用过程中严格按照各个试剂说明书操作。
- 质粒使用过程中细胞相关操作严格控制无菌环境。
- 本质粒提取可能形成二聚体，大小约6.3 kb左右，不影响后续使用。
- 转染时的细胞密度一般控制在80%左右比较合适，不同细胞的最佳转染密度可能有差异。
- 转染效率低：检查质粒质量、细胞状态、转染试剂用量及细胞密度，优化转染条件。
- 转染后细胞异常：减少转染试剂用量，或更换转染试剂，优化转染的细胞密度。
- 慢病毒需要注意保存温度，并且避免多次反复冻融。
- 使用慢病毒感染细胞时，严格控制细胞密度以及最佳使用MOI。
1、本平台所有产品仅供科研使用，不能用于临床试验，包括人体口服、注射或者体外用药；
2、小包装质粒以模板价格出售，只保证基因部分测序正确，不保证质粒的表达等实验效果；
3、某些质粒即使是出品公司亦没有完整测过序，如关键部位的序列测序正确，亦认为是正确质粒；
4、小包装质粒产品的售后期为您收到产品之日起3个月，收到质粒后请及时转化操作，过期需重新购买；
5、质粒构建皆收取的是成本费用，所有质粒会分享给其他实验者，保密性质粒请提前告知并缴纳保密费用；
6、因科学研究为探索未知的活动，存在较大不确定性，故在任何情况下淼灵都不承担额外的连带责任；
7、发表[中文论文]请标注：产品名称(产品货号) 由武汉淼灵生物科技有限公司提供；
8、发表[英文论文]请标注：Product Name (Product Item Number) was obtained from MiaoLingBio,China.
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