pCP20 现货FLP重组酶表达质粒
【基本介绍】
pCP20 是一种携带 FLP重组酶基因的温度敏感型质粒，广泛应用于大肠杆菌基因工程中的抗性基因删除与无痕基因敲除。该质粒同时携带氨苄青霉素（Amp）和氯霉素（Chl）双抗性标记，复制子为温度敏感型（ts），在30℃时可稳定复制，在42-43℃时复制受阻，从而实现质粒的可控消除。
pCP20表达的FLP重组酶可识别FRT位点，介导两个FRT位点之间的DNA片段（如抗性筛选标记）精确切除，留下一个单一的FRT位点，从而实现基因敲除后的无痕化操作。该质粒是Red同源重组系统的核心工具之一，与pKD46、pKD3/pKD4等质粒配合使用，已成为大肠杆菌基因编辑的经典方案。
该产品由武汉淼灵生物科技有限公司现货供应，提供干粉、液体等多种规格，支持即买即用，现货订单平均8小时内发货，助力科研人员快速完成基因工程菌株构建。
【元件信息】
| 元件 | 名称 | 功能描述 |
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| FLP | 酵母Flp重组酶基因 | 识别FRT位点，催化两个FRT位点之间的DNA片段切除 |
| λpR promoter | λ噬菌体pR启动子 | 受温度敏感型cI857抑制子调控，热诱导时启动FLP表达 |
| cI857(ts) | 温度敏感型抑制子 | 30℃时抑制FLP表达，42℃时失活，实现FLP的热诱导表达 |
| bla (AmpR) | 氨苄青霉素抗性基因 | 提供氨苄抗性筛选标记，用于转化子筛选 |
| cat (CmR) | 氯霉素抗性基因 | 提供氯霉素抗性筛选标记 |
| repA101(ts) | 温度敏感型复制子 | 30℃时质粒正常复制，42℃时复制受阻，实现质粒消除 |
| pSC101 ori | pSC101复制起点 | 低拷贝数维持，适用于大肠杆菌 |
【使用说明】
1. 质粒准备：收到质粒后，若为干粉形式，请5000rpm离心1min，加入20μl无菌水溶解，室温放置1min；若为液体形式，可直接使用或分装保存于-20℃。
2. 转化操作：取2μl质粒加入100μl感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min。加入900μl无抗LB培养基，180rpm、30℃复苏培养45-60min。
3. 转化筛选：6000rpm离心5min，留100μl上清重悬菌体，涂布于含氨苄青霉素（100μg/ml） 和/或氯霉素（25μg/ml） 的LB平板上，30℃培养18-24h。
4. 抗性基因删除：挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基（无抗生素），42℃振荡培养过夜，诱导FLP重组酶表达并介导FRT位点间的抗性基因切除。
5. 质粒消除与筛选：将培养物稀释后涂布LB平板，30℃培养过夜。挑取单菌落分别影印至LB+Amp、LB+Cm和LB平板，筛选Amp敏感、Cm敏感的菌落，即为成功删除抗性基因且丢失pCP20质粒的目标菌株。
【应用场景】
Red同源重组抗性基因删除：与pKD46和pKD3/pKD4配合使用，在完成目标基因敲除后，利用pCP20表达FLP重组酶，切除插入的FRT-flanked抗性标记（如KanR、CmR），实现无痕基因敲除。
Keio文库菌株标记清除：用于清除Keio collection等FRT-flanked抗性基因文库菌株中的抗性标记，获得无抗性标记的基因缺失菌株。
多基因连续敲除：由于pCP20可在敲除一轮后被消除，可重复用于同一菌株的多个基因依次敲除，构建多重基因缺失工程菌。
基因工程菌株构建：广泛用于大肠杆菌代谢工程改造，如减少乙酸积累、提高蛋白表达、构建L-乳酸生产菌株等。
【注意事项】
- 本产品仅供科研使用，不能用于临床试验，包括人体口服、注射或者体外用药。
- 质粒溶液可以根据需求加无内毒水稀释至目标浓度。
- 质粒使用量不足时可以转化大肠杆菌扩增抽提或者淼灵购买。
- 操作说明仅供参考，实际使用过程中严格按照各个试剂说明书操作。
- 质粒使用过程中细胞相关操作严格控制无菌环境。
- pCP20为温度敏感型质粒，培养和筛选必须严格控制在30℃，避免使用37℃培养，否则可能导致质粒提前丢失。
- 42℃诱导FLP表达时，质粒复制受阻，培养时间不宜过长，通常6-12小时即可获得足够数量的质粒丢失菌株。
- 转化效率低时：检查感受态细胞质量、抗生素浓度是否准确、培养温度是否稳定控制在30℃。
- 抗性基因删除效率低时：确保42℃诱导充分，适当延长诱导时间至过夜培养。
- 质粒消除筛选时：需同时验证Amp和Cm双敏感，确保质粒已完全丢失。
- 慢病毒需要注意保存温度，并且避免多次反复冻融。
- 使用慢病毒感染细胞时，严格控制细胞密度以及最佳使用MOI。
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1、本平台所有产品仅供科研使用，不能用于临床试验，包括人体口服、注射或者体外用药；
2、小包装质粒以模板价格出售，只保证基因部分测序正确，不保证质粒的表达等实验效果；
3、某些质粒即使是出品公司亦没有完整测过序，如关键部位的序列测序正确，亦认为是正确质粒；
4、小包装质粒产品的售后期为您收到产品之日起3个月，收到质粒后请及时转化操作，过期需重新购买；
5、质粒构建皆收取的是成本费用，所有质粒会分享给其他实验者，保密性质粒请提前告知并缴纳保密费用；
6、因科学研究为探索未知的活动，存在较大不确定性，故在任何情况下淼灵都不承担额外的连带责任；
7、发表[中文论文]请标注：产品名称(产品货号) 由武汉淼灵生物科技有限公司提供；
8、发表[英文论文]请标注：Product Name (Product Item Number) was obtained from MiaoLingBio,China.
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1、
Zefang Zhang;Ning Zhu;Guangrui Yang;Feifan Leng;Yonggang Wang,Bioinformatics analysis of gene bhsA and its role in Ca2+-treated Escherichia coli,2023-4-26,DOI:10.1002/jobm.202300222,(IF:3.5)
2、
Ning Zhu; Shangchen Sun; Feifan Leng; Wenguang Fan; Jixiang Chen; Jianzhong Ma; Haining He; Guangrui Yang,Identification of Key Genes during Ca2+-Induced Genetic Transformation in Escherichia coli by Combining Multi-Omics and Gene Knockout Techniques,2022-10-18,DOI:10.1128/aem.00587-22,(IF:3.1)