全功能验证型质粒 —— 卓越品质，开箱即用，助您实验一次成功

我们提供的每一管全功能验证型质粒，均经过严格的生产与质检流程，确保其具备以下核心优势：

       严格质控，数据可靠：产品具备高纯度、高超螺旋比例与极低内毒素水平，并经无菌处理。每一批次均通过全长测序验证，确保序列完全正确。
       即用便捷，省时省力：质粒为即用型液体，浓度已精准标准化为1 μg/μl，收到后瞬时离心即可直接用于转染、酶切等后续实验，无需您自行测定、稀释与纯化。
       现货速发，全程保障：我们承诺快速发货，采用冰袋运输，以保障质粒活性。产品在-20℃条件下保质期可达1年，请您安心储存与使用。

各批次质粒的详细质检报告（CoA）可在产品详情页“产品文件”栏中查看与下载，我们承诺所有数据真实、透明、可追溯。

【 严苛的生产标准】        质粒转化————  质粒提取————  质粒测序————  功能检测————  质粒出库
       1、转化后的90mm平板上的菌落数=10~300个。
       2、摇菌培养后的菌液无特殊杂菌异味和沉淀。       
       3、肉眼观察质粒外观澄清、透明、无异物。

 
       4、微量分光光度计检测液体质粒，浓度为1071ng/μL，A260/A280=1.94，A260/A230=2.36。

       5、原始质粒电泳条带单一，大小正确，超螺旋比例超过90%。
       6、质粒酶切后条带个数和条带大小与理论一致，无其他杂带出现。

 
       7、全长测序序列与参考序列匹配率为100%。

      
       8、细菌内毒素含量＜0.1 EU/μg。

       9、培养法测试液体质粒不含杂菌。

       10、台盼蓝染色法测试液体质粒无细胞毒性。

       11、慢病毒包装实验，P40122的未浓缩病毒的滴度不低于1×10E7 TU/ml。

【基本介绍】
       慢病毒属于一种工具病毒，感染目的细胞即可实现基因敲除、敲降和过表达等目的。pMD2.G是一种广泛应用于慢病毒包装系统的辅助质粒。该质粒载体中携带来源于水疱性口炎病毒（VSV）的G蛋白基因，其编码的VSV-G包膜蛋白在病毒包装过程中替换慢病毒原有的包膜，VSV-G可识别细胞膜上广泛存在的磷脂酰丝氨酸等受体，使包装出的慢病毒能够感染绝大多数哺乳动物细胞类型，包括难转染的原代细胞、干细胞、甚至非分裂细胞。同时VSV-G包膜蛋白显著增强病毒颗粒的物理稳定性，是获得高滴度、高感染效率慢病毒的关键。 

【元件信息】
        CMV promoter 高效表达VSV-G包膜蛋白
        β-globin内含子 主要用于增强基因表达的稳定性和效率
        VSV-G 编码病毒包装所需要的包膜蛋白
        β-globin poly(A) 增强mRNA稳定性，促进翻译效率‌
        pUC复制起始点 允许在大肠杆菌中进行高拷贝数复制和生长
        AmpR 氨苄青霉素抗性基因，允许在大肠杆菌中筛选转化体

【使用说明】
一、慢病毒包装
        1、准备细胞：提前一天接种HEK 293T细胞至10cm培养皿。
        2、制备DNA-PEI混合物：1.5mL EP管中加入0.25mL无血清DMEM，按一定比例加入总量16μg的质粒混合物，比例是按目的质粒：P0261:P0262=4:3:1 ，涡旋振荡仪3000rpm，5~10 s震荡混匀，另取一个1.5mL EP加入0.25 mL无血清DMEM和48 μL PEI Pro（转染试剂加之前要涡旋混匀），用枪头轻吹混匀，将PEI Pro混合物加入质粒混合物中，轻吹混匀后静置15min。
        3、转染细胞：将制备好的DNA-PEI Pro混合物滴加入培养皿中。加完后放置于37℃，5%CO2培养箱培养4-6 h。培养时间到后换新鲜的完全培养基，放置于37℃，5%CO2培养箱培养。
        4、病毒收集：转染48h后收集上清于50 mL离心管，4℃，5000rpm离心10min。上清液用30 mL注射器和0.45 µm过滤器过滤到新的离心管中。
二、慢病毒滴度测定：慢病毒滴度测定的方法有多种，如流式细胞、ELISA以及RT-qPCR等检测方法，本说明以RT-qPCR方法阐述慢病毒滴度测定操作。
        1、细胞准备：提前一天接种HEK 293T细胞至24孔板：将细胞消化计数后稀释至1*10E5个/mL，每孔加入500 μL细胞悬液，按标准品4个孔，对照组1个孔，待测病毒2个孔，设定待测试样本为N，准备的细胞孔数为5+(2×N)。
        2、标准品病毒稀释：无菌操作台中，准备4个无菌1.5 mL的EP管，按标1-4做好标记，再向标记为标2，标3和标4的EP管各加入90 μL完全培养基。取轻柔吹打混匀的标准品病毒液50 μL加入标记为标1的1.5 mL EP管中；取标记为1的EP管的病毒液10 μL加入标记为标2的1.5 mL EP管中，轻柔吹打混匀，依次以10倍梯度稀释至标记为标3和标4的EP管。
        3、待测病毒稀释：无菌操作台中，准备2个无菌1.5 mL的EP管，按a-b做好标记后每管加入90 μL完全培养基，取混匀的病毒原液10 μL加入装有90 μL完全培养基标记为a的1、5 mL EP管中，轻柔吹打混匀5次左右；取标记为a的EP管的病毒稀释液10 μL加入标记为b的1.5 mL EP管中，轻柔吹打混匀5次左右。
        4、标准品病毒感染：将标1至标4管内的病毒液各取10 μL加入铺有细胞的24孔板中，留一孔不加病毒处理，作为对照组。
        5、待测病毒感染：同时将标a和b的病毒稀释液各取10 μL加入铺有细胞的24孔板中，加完后将孔板放置于培养箱于37℃，5% CO2条件中培养72 h。
        6、按试剂盒说明书的步骤提取细胞总RNA。
        7、按试剂盒说明书步骤反转录cDNA。
        8、配制样本上机进行RT-qPCR检测。
        9、根据标准品滴度和Ct制作的标准曲线公式计算待测样本的慢病毒滴度。

【注意事项】
        1、本产品仅供科研使用，不能用于临床试验，包括人体口服、注射或者体外用药。
        2、质粒溶液可以根据需求加无内毒水稀释至目标浓度。
        3、质粒使用量不足时可以转化大肠杆菌扩增抽提或者淼灵购买。
        4、操作说明仅供参考，实际使用过程中严格按照各个试剂说明书操作。
        5、质粒使用过程中细胞相关操作严格控制无菌环境。
        6、本质粒提取可能形成二聚体，大小11kb左右，不影响后续使用。
        7、转染时的细胞密度一般控制在80%左右比较合适，不同细胞的最佳转染密度可能有差异。
        8、转染效率低：检查质粒质量、细胞状态、转染试剂用量及细胞密度，优化转染条件。
        9、转染后细胞异常：减少转染试剂用量，或更换转染试剂，优化转染的细胞密度。
        10、慢病毒需要注意保存温度，并且避免多次反复冻融。
        11、使用慢病毒感染细胞时，严格控制细胞密度以及最佳使用MOI。