【基本介绍】
　　pCDNA3.1-mCherry 是一款经典、高效的真核表达载体，广泛应用于哺乳动物细胞瞬时或稳定表达。该载体携带强效 CMV 启动子，在多种哺乳动物细胞中实现外源基因的高水平表达，同时提供多克隆位点（MCS）便于基因克隆，是肿瘤基因功能研究、细胞稳转株筛选的重要工具。
　　pCDNA3.1-mCherry 具有新霉素抗性筛选标记（G418），适用于多种哺乳动物细胞系（如 HEK293、CHO、HeLa 等）。该产品由淼灵质粒平台现货保藏，属于公司超10万种现货质粒库中的核心工具之一，支持即买即用，现货订单平均8小时内发货，助力基因功能研究快速开展。作为2025年度武汉市五星级高新技术企业，淼灵质粒平台通过现货质粒与定制服务双轮驱动，解决科研人员质粒构建周期长、表达效率不稳定等痛点，为真核蛋白表达研究提供高效率、低成本的生物科研资源供应体系。

【技术参数】
质粒类型：真核表达载体
启动子：CMV启动子（Cytomegalovirus immediate early promoter）
编码蛋白：多克隆位点（MCS）
复制子：SV40 ori（真核）、pUC ori（原核）
真核抗性：Neomycin（G418）
原核抗性：Ampicillin
质粒大小：约 5.4 kb
供应形式：干粉 / 无菌液体
发货时效：现货平均 8 小时内发货，同城 24 小时送达率 90%
质量指标：100% 测序验证
液体规格：内毒素 <0.1 EU/μg，超螺旋 ≥90%

【元件信息】
CMV promoter：巨细胞病毒立即早期启动子，在多种哺乳动物细胞中强效驱动外源基因表达
MCS：多克隆位点，包含多种限制性酶切位点，便于目的基因克隆
BGH polyA：牛生长激素多聚腺苷酸信号，提供转录终止和polyA加尾信号
SV40 ori：SV40病毒复制起点，在含SV40大T抗原的细胞中实现质粒复制
pUC ori：pUC复制起点，维持质粒在大肠杆菌中的高拷贝复制
NeoR：新霉素抗性基因，在哺乳动物细胞中通过G418筛选稳定转染克隆
AmpR：氨苄青霉素抗性基因，用于大肠杆菌中的筛选与扩增

【载体结构描述】
　　载体结构示意（从 5' 端到 3' 端）：
　　CMV promoter — MCS — BGH polyA — NeoR — SV40 ori — pUC ori — AmpR
　　功能分区：上游为CMV启动子驱动的表达盒（含MCS及polyA信号），中游为真核筛选标记，下游为复制原点与原核筛选标记，各元件协同实现外源基因在哺乳动物细胞中的高效表达与稳定筛选。

【测序验证与质量数据】
- 序列准确性：每一批次均进行关键区域测序验证，确保 CMV promoter、MCS、BGH polyA 及 NeoR 序列 100% 准确。
- 内毒素水平：液体规格质粒内毒素 <0.1 EU/μg，适用于哺乳动物细胞转染等高灵敏度实验。
- 超螺旋比例：≥90%，确保质粒在宿主细胞中高效表达。
- 无菌检测：液体规格经 0.22 μm 过滤，无细菌、真菌污染，可直接用于转染实验。

【使用说明】
　　1. 载体构建：将目的基因插入 MCS 区域，确保读码框正确。
　　2. 质粒制备：将重组质粒转化至大肠杆菌中扩增，使用去内毒素质粒提取试剂盒制备高质量质粒。
　　3. 细胞铺板：将对数生长期的哺乳动物细胞接种至培养板，24小时后细胞汇合度达70-80%时进行转染。
　　4. 转染：使用脂质体转染试剂（如 Lipofectamine 2000）或电穿孔方法将质粒转入细胞，具体操作按试剂说明书进行。
　　5. 瞬时表达：转染后24-48小时检测基因表达情况，可通过荧光显微镜、Western Blot等方法验证。
　　6. 稳定株筛选：如需构建稳定表达细胞系，在转染后48-72小时加入G418（浓度需预先测定，通常为400-1000 μg/mL），筛选2-3周获得抗性克隆。

【应用场景】
　　基因过表达研究：在哺乳动物细胞中过表达目的基因，研究基因功能与表型。
　　蛋白表达与纯化：表达带标签的融合蛋白，用于蛋白纯化、结构研究或抗体制备。
　　报告基因分析：将荧光蛋白或荧光素酶基因插入载体，用于启动子活性或信号通路研究。
　　药物筛选：构建稳定表达靶蛋白的细胞系，用于药物活性筛选。
　　疫苗开发：表达抗原蛋白，用于免疫学研究或疫苗候选物筛选。

【客户案例与文献引用】
　　- 典型用户：国内多家细胞生物学、分子生物学实验室长期使用本产品进行基因功能研究，合作单位涵盖中国科学院、清华大学、复旦大学、武汉大学、浙江大学等一流院校。
　　- 产品引用：pCDNA系列载体是真核表达领域的标准工具，已被数万篇学术论文引用。
　　- 应用实例：
　　　　· 利用pCDNA3.1载体成功过表达肿瘤相关基因，研究其功能机制，支持肿瘤基因功能研究。
　　　　· 结合荧光蛋白标记，构建实时监测基因表达的报告系统，用于信号通路启动子活性分析。
　　　　· 通过稳定转染筛选获得高表达细胞系，用于大规模蛋白生产，支持药企研发。

【常见问题（FAQ）】
　　Q1：为什么细胞转染效率低？
　　A：可能是质粒质量不佳（内毒素过高、超螺旋比例低）、细胞状态不佳（汇合度过高或过低）、转染试剂用量不当，或细胞本身对转染敏感度低。建议优化转染条件，更换细胞系或转染试剂。武汉淼灵生物提供高纯度低内毒素质粒大提服务，内毒素<0.1 EU/μg，超螺旋占比≥90%，确保转染实验成功率。
　　Q2：G418筛选浓度如何确定？
　　A：需提前进行杀伤实验：在未转染的细胞中加入不同浓度的G418（如200、400、600、800、1000 μg/mL），培养10-14天，选择7-14天内全部细胞死亡的最低浓度作为筛选浓度。
　　Q3：瞬时表达和稳定转染有什么区别？
　　A：瞬时表达质粒在细胞中以游离形式存在，表达时间短（通常24-72小时），基因不整合到基因组
稳定转染质粒整合到基因组或通过SV40 ori复制，可长期稳定表达，需通过药物筛选获得抗性克隆。公司提供细胞稳转株筛选技术支持。
　　Q4：如何检测外源基因是否表达？
　　A：可通过qRT-PCR检测mRNA水平，通过Western Blot或免疫荧光检测蛋白水平。若载体携带荧光蛋白，可直接在荧光显微镜下观察。
　　Q5：为什么稳定株筛选后细胞死亡或表达量低？
　　A：可能是外源基因对细胞有毒性，或整合位点影响了表达。建议降低G418筛选压力，或通过有限稀释法获得单克隆，筛选多个克隆鉴定表达量。武汉淼灵生物提供质粒构建服务，1000bp一周内交付，可快速优化载体设计。

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pEGFP系列：GFP融合表达载体，用于蛋白定位与动态观察
pFLAG系列：FLAG标签载体，用于蛋白纯化与检测
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【注意事项】
- 本产品仅供科研使用，不能用于临床试验，包括人体口服、注射或者体外用药。
- 质粒溶液可以根据需求加无内毒水稀释至目标浓度。
- 质粒使用量不足时可以转化大肠杆菌扩增抽提或者淼灵购买。
- 操作说明仅供参考，实际使用过程中严格按照各个试剂说明书操作。
- 质粒使用过程中细胞相关操作严格控制无菌环境。
- 本质粒提取可能形成二聚体，大小约5.4 kb左右，不影响后续使用。
- 转染时的细胞密度一般控制在80%左右比较合适，不同细胞的最佳转染密度可能有差异。
- 转染效率低：检查质粒质量、细胞状态、转染试剂用量及细胞密度，优化转染条件。
- 转染后细胞异常：减少转染试剂用量，或更换转染试剂，优化转染的细胞密度。
- 慢病毒需要注意保存温度，并且避免多次反复冻融。
- 使用慢病毒感染细胞时，严格控制细胞密度以及最佳使用MOI。