同源重组法构建质粒

什么是质粒构建？

       质粒构建是分子生物学研究中常用的实验技术，质粒是能够实现自主复制的环状DNA分子，质粒构建即是将特定的基因序列插入到工程质粒中，再把质粒转化到细菌、细胞或者酵母中，使得质粒能够在其中表达的过程。

同源重组法构建质粒的原理是？

       将选定的目的外源基因（DNA）进行PCR扩增后，用限制性内切酶切割载体，再使用同源重组酶将切割后的载体与DNA片段连接后转入宿主细胞，最后经过筛选和测序鉴定出正确的重组克隆质粒，实现目的基因再宿主细胞内的表达。

用途是什么？

       用于外源蛋白的过表达。

需要哪些材料和仪器？

       目的片段的cDNA、引物、载体、限制性内切酶、酶切buffer、LB培养基、含LB培养基的细菌培养皿、同源重组酶、高保真酶、感受态细胞DH5α、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、EP管、离心管、移液枪及枪头等等。

有哪些步骤？

       同源重组法构建质粒的步骤如下：

①根据目的片段的酶切位点，选择相应的内切酶，通过双酶切法将环状载体质粒切割成线性化载体，用琼脂凝胶法回收酶切产物，回收具体方法按照试剂盒来操作；

②用PCR法扩增目的片段的序列，用琼脂糖凝胶法回收扩增产物；

③将线性化的载体与扩增的片段按比例进行连接，50℃条件下，30min或更长时间（1~2h）。将连接好的重组质粒（10μl）转入克隆感受态细胞DH5α，轻轻吹打均匀（注意一定不要通过振荡来混匀），冰上静置30min，然后42℃水浴热激90s后立即置于冰上静置冷却2~3min；

④加入500μl不添加抗生素的LB液体培养基，37℃摇菌1h，转速250rpm；

⑤将上一步的菌液在5000rpm条件下离心5min，弃去上清300μl。再用剩余培养基将菌体重悬，最好是能够按照不同的梯度来进行涂板操作，防止单克隆菌过密或者过疏，用无菌涂布棒在含有质粒抗性的平板上涂匀后，放置于37℃的培养箱中培养10~12h；

⑥过夜后，用1μl枪头挑单克隆菌，放置于5ml的含抗生素的LB液体培养基中继续培养10~12h；

⑦质粒小提试剂盒提取菌液中的重组质粒后，用限制性内切酶消化后，进行琼脂糖电泳做酶切鉴定；

⑧在进行第七步的同时，可以吸取部分菌液做菌液PCR，PCR产物琼脂糖凝胶电泳通过观察条带大小来进一步鉴定重组质粒是否正确；

⑨将鉴定成功的菌液送到测序公司进行双向测序，待测序结果比对正确后，表示重组质粒构建成功，可以进行下游实验。

注意！！！

1.构建质粒的时候，目的基因片段不要大于载体的长度，如果基因片段为载体长度的1/2以上，会加大连接的难度；

2.如果后续的质粒需要做蛋白表达，那么在最开始选择载体的酶切位点时就要注意是否会发生移码突变，否则后续蛋白表达会出错；

3.同源重组法的引物设计需要在插入片段正/反向PCR引物5‘端引入线性化载体的末端序列，使得PCR产物5’和3‘最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列（15~20bp），同源臂的GC含量尽可能低于60%，酶切序列可以选择性去增加，如果增加的话能够便于后续的酶切鉴定；

4.做感受态转化实验时，注意重组质粒的体积不超过感受态的1/10，否则可能导致实验失败。

常见问题

1.胶回收的产物低、浓度不足以做连接时，可以增加实验的起始量，因为大部分胶回收试剂盒的回收率仅为30%~60%，所以载体酶切和扩增片段时可以用100μl的跑胶体积；

2.扩增的PCR产物无条带或者条带弱时，需要检查引物的Tm值以及GC比，可以更换引物或者改变PCR的条件，使其达到最优；

3.涂板后没有菌落或很少菌落时，可能是线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足或者过量，或者比例不佳，也可能是使用单酶切载体后载体自连所导致，建议使用双酶切法切割载体，防止自连；

4.菌液PCR无条带，可能是载体连接不成功，引物设计问题所导致的。