同源重组试剂盒说明书
l产品信息
| 货号 | 名称 | 规格 | 保存温度 |
|---|---|---|---|
| QT0042 | 2×重组试剂 | 50μL | 负20℃ |
l产品简介
本试剂盒采用的是DNA无缝克隆技术，可快速将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。使用任意方式将载体进行线性化，在插入片段正/反向扩增引物5’端引入线性化载体的末端序列，使得PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15-20 bp)。这种两端带有载体末端一致序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在重组酶的催化下，50℃反应15-60min即可进行转化，完成定向克隆。试剂盒中的2×Mix预混了重组酶和重组反映所需缓冲液，并添加了特殊试剂，可显著提高重组克隆效率，可以兼容一至五个片段同源重组。
1、于冰上配制以下反应体系：
2×重组试剂 5μL
线性化克隆载体 XμL
插入片段(PCR扩增产物) YμL
ddH2O up to 10μL
注:如果不慎将液体粘在管壁，短暂离心将反应液收集至管底。
线性化载体与插入片段的使用量
单片段同源重组反应：
最适克隆载体使用量= [0.02×克隆载体碱基对数]ηg(0.03 pmol)
最适插入片段使用量= [0.04×插入片段碱基对数]ηg(0.06 pmol)
多片段同源重组反应(2 - 5个多片段)：
最适克隆载体使用量= [0.02×克隆载体碱基对数]ηg(0.03 pmol)
每个片段的最适使用量= [0.02×每个片段碱基对数]ηg(0.03 pmol)
注:为了确保加样的准确性，在配制重组反应体系前可将线性化载体与插入片段适当稀释，各组分加样量不低于1μL。
2.重组反应
(1)在冰盒上解冻重组试剂，颠倒混匀。
(2)在无菌管中加入载体会和片段，用无菌水补足至5μL，最后加入重组试剂，用移液枪轻轻吹打混匀避免产生气泡。
(3)单片段重组反应，50℃，15 min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
多片段重组反应，50℃，30 min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
3.转化
(1)将克隆用的化学感受态细胞置于冰上解冻。
(2)取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30 min。
注:重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10；
(3)42℃水浴热激45-90s后，立即置于冰上冷却2-3 min。
(4)加入900μL SOC或LB无抗液体培养基，37℃摇菌1 h(转速200 - 250 rpm)。
(5)取适当体积菌液均匀涂布于含有正确抗性的平板上，于37℃培养箱中倒置过夜培养。
4.克隆鉴定
菌落PCR。挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定，扩增引物至少使用一条载体上的通用测序引物。
l注意事项
1、保存条件：-20℃保存12个月，避免反复冻融。
2、适用范围：快速克隆、高通量克隆、无缝克隆、DNA定点突变
l常见问题与解决方案
1、与传统方法相比，此法有哪些优势？
重组试剂可将1-5个片段一次性组装到线性化载体上，克隆片段无内切位点限制，克隆效率高于普通酶切连接。
2、引物如何设计?
①引物设计:推荐引物设计软件CE Design，选择相应模块进行设计。
②载体的线性化方式有三种：双酶切、单酶切、反向PCR，优先选择双酶切。
③引物三部分：同源臂(15-20 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40% - 60%)+酶切点+ 特异性引物。
3、为什么平板上未长出克隆或克隆数目很少？
①引物设计不正确:引物包含15-20bp同源臂(不计算酶切位点)，GC含量40% - 60%。
②线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳:尽量按照说明书中推荐的量和比例配制重组反应体系。
③载体和插入片段不纯，抑制反应:未纯化DNA使用体积不应超过反应体系体积的1/5；建议线性化载体、PCR产物进行凝胶回收纯化。
④感受态细胞效率低。
4、为什么菌落PCR无条带？
①引物不正确:推荐使用载体的通用引物进行菌检，或至少使用一条通用引物。
②PCR体系或程序不合适:没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。
③重组失败:只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。
5、可以组装200bp以下的片段吗？
可以，为了组装效果更佳，推荐插入片段的使用量为载体的三倍以上。
